Nouvel antigène | Débitmètre Cie., Ltd de Tianjin

Nature volume 610, pages 752-760 (2022)Citer cet article

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L’établissement et le maintien d’une tolérance aux auto-antigènes ou aux antigènes étrangers inoffensifs sont essentiels à la préservation de la santé de l’organisme. Dans le thymus, les cellules épithéliales thymiques médullaires (mTEC) exprimant le régulateur auto-immun (AIRE) jouent un rôle essentiel dans l'autotolérance grâce à la suppression des cellules T autoréactives et à la promotion du développement des cellules T (Treg) régulatrices thymiques 1,2,3,4. Quelques semaines après la naissance, une vague distincte de différenciation des cellules Treg se produit en périphérie lors de l'exposition à des antigènes dérivés de l'alimentation et du microbiote commensal5,6,7,8, mais les types de cellules responsables de la génération de cellules Treg périphériques (pTreg) ont pas été identifié. Nous décrivons ici l’identification d’une classe de cellules présentatrices d’antigène RORγt+ appelées cellules Thetis, présentant des caractéristiques transcriptionnelles à la fois des mTEC et des cellules dendritiques, comprenant quatre sous-groupes principaux (TC I – TC IV). Nous découvrons une vague de développement de cellules Thetis dans les ganglions lymphatiques intestinaux au cours d'une fenêtre critique du début de la vie, coïncidant avec la vague de différenciation des cellules pTreg. Alors que TC I et TC III exprimaient le facteur nucléaire signature mTEC AIRE, TC IV manquait d'expression d'AIRE et était enrichi en molécules nécessaires à la génération de pTreg, y compris l'intégrine activatrice du TGF-β αvβ8. La perte du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (MHCII) ou d'ITGB8 par les cellules Thetis a entraîné une profonde altération de la différenciation intestinale des pTreg, entraînant une colite. En revanche, l’expression du MHCII par les cellules lymphoïdes innées RORγt+ du groupe 3 (ILC3) et les cellules dendritiques classiques n’était ni suffisante ni requise pour la génération de pTreg, impliquant en outre TC IV en tant que cellule tolérogène RORγt+ présentatrice d’antigène ayant une fonction essentielle au début de la vie. Nos études révèlent des voies parallèles pour l'établissement d'une tolérance au soi et aux antigènes étrangers dans le thymus et la périphérie, respectivement, marquées par l'implication de programmes cellulaires et transcriptionnels partagés.

Dans le thymus, une lignée distincte de cellules épithéliales établit une tolérance aux auto-antigènes par la suppression des cellules T autoréactives et la promotion de la différenciation des cellules Treg1,2,3,4. Ces fonctions des mTEC sont médiées en partie par l'expression d'AIRE, qui régule l'expression ectopique d'antigènes restreints aux tissus1. Un autre site majeur d'induction de tolérance réside dans le tissu lymphoïde intestinal, où le système immunitaire en développement d'un nourrisson est exposé à de nombreux nouveaux composants alimentaires et microbes colonisateurs lors du sevrage. L’établissement d’une relation harmonieuse hôte-microbiote au cours de cette fenêtre de développement précoce est essentiel pour prévenir l’apparition ultérieure de troubles à médiation immunitaire7,9. La différenciation des cellules T naïves en cellules Treg générées de manière périphérique (pTreg) lors de leur rencontre avec des antigènes dérivés du commensal est essentielle à l'établissement de la tolérance aux microbes intestinaux. Pourtant, l’identité de la cellule présentatrice d’antigène (APC) qui favorise la différenciation des cellules pTreg n’est pas connue. La fenêtre temporelle étroite pour l’établissement de l’homéostasie immunitaire intestinale suggère la présence d’un APC tolérogène limité au développement dans la niche intestinale néonatale.

Les cellules pTreg extra-thymiques, distinguées de leurs homologues thymiques par l'expression du récepteur nucléaire orphelin RORγt, apparaissent dans les ganglions lymphatiques mésentériques (mLN) en réponse aux antigènes bactériens commensaux et jouent un rôle essentiel dans la suppression des réponses immunitaires inflammatoires contre les microbes intestinaux6,11. À l’inverse, les souris déficientes en présentation d’antigènes restreints au MHCII par les cellules RORγt+ (MHCIIΔRORγt) développent une inflammation intestinale sévère car elles n’établissent pas de tolérance aux bactéries commensales12, suggérant un lien potentiel entre les APC RORγt+ et la génération de cellules RORγt+ pTreg. Pour répondre à cette possibilité, nous avons analysé des souris MHCIIΔRORγt à l'âge de trois semaines, lorsque les cellules pTreg s'accumulent dans l'intestin . Nous avons observé une réduction marquée du nombre de cellules RORγt + pTreg dans le mLN et la lamina propria du côlon, ainsi qu'une expansion des cellules effectrices CD44hi T (Teff) (Fig. 1a – d et Données étendues, Fig. 1a). À l'âge de huit semaines, ces souris ont présenté une réduction soutenue et sévère des cellules RORγt + pTreg ainsi qu'une expansion des cellules T helper 17 (TH17) du côlon (Fig. 1e et Extended Data, Fig. 1b), conformément aux études précédentes démontrant un effet important. rôle des cellules RORγt+ pTreg spécifiques du pathobionte dans la suppression des cellules TH17 inflammatoires11. L'analyse histologique a démontré une colite sévère avec un infiltrat cellulaire inflammatoire marqué, une ulcération de la muqueuse et une perte de cryptes (Fig. 1f, g), confirmant le rôle essentiel des APC RORγt + dans la prévention des réponses immunitaires intestinales dérégulées.

1.5, adjusted P < 0.01) for each Thetis cell cluster. h, Dot plot showing expression of selected cell-surface markers that are differentially expressed between Thetis cell subsets. i, Gating strategy for identification of Thetis cell subsets. j, Intracellular expression of AIRE protein by Thetis cell subsets; each symbol represents an individual mouse (n = 4). k, summary of TC I–TC IV phenotypes. Plots in i are representative of n = 6 mice from 3 independent experiments. Data in b,e,j are representative of 3 independent experiments. Box plots in c indicate median (centre line) and interquartile range (hinges), whiskers represent minimum and maximum values, and dots represent outliers./p>

50,000 cells (viability 95%) were lysed for 4 min and resuspended in Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics, 2000207). Lysis efficiency and nuclei concentration was evaluated on Countess II automatic cell counter by trypan blue staining. Nuclei (9,660 per transposition reaction) were loaded, targeting recovery of 6,000 nuclei after encapsulation. After the transposition reaction, nuclei were encapsulated and barcoded. Next-generation sequencing libraries were constructed following the manufacturer’s instructions, and were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 system./p>

1,000 and < 50,000), the number of detected genes (>500 and < 6,000), and the fraction of mitochondrial transcripts (<15%). Barcodes were further filtered based on the number of scATAC-seq fragments (3.5 < log10(number of fragments) < 4.5) and transcription start site enrichment score (>4). Arrow files were created from the scATAC-seq fragments using ArchR v1.0.154, and doublets were identified and removed with default parameters. Finally, any genes detected in <2 cells in the scRNA-seq data were discarded, leaving 20,779 genes. After clustering, the scRNA-seq data (described in ‘Dimensionality reduction, cell clustering, and visualization’), and based on the expression of marker genes, we identified 5 minor contaminant clusters (glial cells; cluster 17, plasmacytoid dendritic cell; cluster 18, Rorc–/lo CCR7+ dendritic or Thetis cell; cluster 19, mixed monocyte/cDC1; cluster 20, and macrophage; cluster 21) which were excluded from downstream analyses. In total, 10,145 cells remained, with a median scRNA-seq library size of 3,150 and a median of 13,885 scATAC-seq fragments./p>50,000), number of detected genes (>1,300), and the fraction of mitochondrial transcripts (<8%). Finally, genes detected in <2 cells were discarded. A total of 481 cells remained, with a median library size of 924,319 from 27,195 genes./p>1.5) and adjusted P value (<0.01). Ribosomal and mitochondrial genes were removed from the final list of genes reported or visualized. Where stated, the top DEG markers were subsequently selected for each group, based on fold change./p>

1.3, adjusted P < 0.01) comparing the scRNA-seq clusters in a one-vs-rest test, that were also expressed in the microarray data. The proliferating and progenitor clusters were excluded from the differential expression test, and the LTi clusters were grouped together. For visualization of results, only cell lineages containing a cell type with > 0.25 cosine similarity with either Thetis cell or ILC3 clusters were plotted./p>

1.3, adjusted P < 0.01) identified in a one-vs-rest differential expression test for non-proliferating Thetis cell clusters (2–5), that were also expressed in the thymic epithelial cells. Among individual clusters of thymic epithelial cells defined in the original dataset, we identified 2 clusters of transit amplifying AIRE+ cells (clusters 25 and 26), distinguished by signature gene expression including cell cycle genes./p> 1.5, adjusted P < 0.01), we identified orthologous human genes that were uniquely mapped by gprofiler2 and computed enrichment scores for Thetis cell subset gene signatures for each human cell./p>0.001 of the sequence) were filtered. Regions from all groups were compiled and overlapping regions were merged to their union, resulting in a non-overlapping set of 176,942 peaks. A peak-by-cell count matrix was created by ArchR with a ‘ceiling’ value of 4 for the counts to avoid strong biases./p> 1 h at room temperature, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in acetone, and processed for Epon embedding. Ultrathin sections (60–65 nm) were counterstained with uranyl acetate and lead citrate. Images were taken with a transmission electron microscope (Tecnai G2–12; FEI) equipped with a digital camera (AMT BioSprint29)./p>

1.5, P < 0.01). d, Expression score of cell-cycle genes for each scRNA-seq cluster. e, Dot plot showing expression of myeloid genes. f, Flow cytometry of Zbtb46 (GFP) expression in ILC3 subsets from mLN of 3-week-old Zbtb46GFPRorgtcreR26lsl-tdTomato mice. Representative of n = 4 mice from two independent experiments. g-h, CellTypist derived cell labels for cell clusters from Fig. 2g, using a broad classification (g) or finer cell type annotation (h). i, Correspondence between cell labels for scATAC-seq and scRNA-seq./p>

1.5, adj. P < 0.01) between Aire+ mTEC and TC I. i, Bar graph showing log-normalized expression of Ptprc and Rorc genes in Aire+ mTECs and TCs. j, Flow cytometry of RORγt expression in Aire+ mTECs isolated from P18 RorcVenus-creERT2AireGFP mice. k, Heatmap reporting scaled expression values for top differentially expressed genes (FC > 1.5, adj. P < 0.01) between indicated SS2 clusters (f). Data in a,b are representative of > 3 independent experiments. Data in j representative of n = 5 mice from two independent experiments./p>